激肽释放酶原激活剂测定法

3409 激肽释放酶原激活剂测定法
    本法系采用显色底物法（或显色基质法）测定供试品中激肽释放酶原激活剂（PKA）含量。
    试剂  （1）0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液（含0.15mol/L氯化钠溶液，简称TNB）  称取6.06g三羟甲基氨基甲烷（Tris，分子量为121.14）及8.77g氯化钠，加适量水溶解后，用1mol/L盐酸调pH值至8.0，补加水至1000ml。
    （2）2mmol/L激肽释放酶显色底物（S-2302）溶液  称取S-2302 12.5mg，加10ml水溶解。
    （3）前激肽释放酶（PK）  采用适宜方法提纯PK，小体积分装，-30℃以下保存备用。
    PKA标准品溶液的制备  取PKA标准品适量，用0.85%氯化钠溶液分别稀释成每1ml中含10.0IU、20.0IU、30.0IU、40.0IU、50.0IU的溶液。按每次用量，小体积分装，-30℃保存备用。用前融化（仅允许冻融1次），并用TNB稀释10倍。
    供试品溶液的制备  取供试品适量，用TNB稀释10倍。
    测定法  取供试品溶液20μl，加至96孔微量滴定板孔内，加PK 20～50μl，同时开动秒表计时，向每孔加PK的时间间隔应相同，将微孔滴定板振荡1分钟；加盖，于25～30℃放置30分钟后，按加PK的顺序和时间间隔向各反应孔加2mmol/L S-2302溶液20μl，振荡1分钟；加盖，于25～30℃放置15分钟后，再以同样的加液顺序和时间间隔加50%醋酸溶液20μl，振荡1分钟后，照紫外可见分光光度法（通则0401），在波长405nm处测定吸光度；同时以TNB 20～50μl代替PK 20～50μl，同法操作，作为空白对照。用PKA标准品溶液的20μl替代供试品溶液，同法操作。以PKA标准品溶液的PKA活性的对数对其相应的吸光度对数作直线回归，求得直线回归方程，计算出供试品PKA活性。
    【附注】（1）每个PKA标准品溶液和供试品溶液做3孔，其中2个为测定孔、1个为对照孔，2个测定孔吸光度差值应小于0.020。
    （2）每次测定可根据供试品PKA含量，适当调整PKA标准品溶液的范围。
    （3）线性回归的相关系数应不低于0.99。
    （4）加PK、S-2302及50%醋酸溶液时，各孔的间隔时间应相同，加液的顺序要一致，尽可能使各孔处于同一反应条件下。
    （5）加PK和加S-2302溶液后的放置时间系从第一孔加液时算起。
    （6）如放置温度低于25℃，应分别在两次反应过程的限定时间内于37℃放置10分钟。