免疫斑点法

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3402 免疫斑点法    本法系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。
    试剂  （1）TG缓冲液  精密称取三羟甲基氨基甲烷15.12g与甘氨酸72g，加水溶解并稀释至500ml。4℃保存。
    （2）EBM缓冲液  量取TG缓冲液20ml、甲醇40ml ，加水稀释至200ml。4℃保存。
    （3）TTBS缓冲液  称取三羟甲基氨基甲烷6.05g、氯化钠4.5g，吸取聚山梨酯80 0.55ml，加适量水溶解，用盐酸调pH值至7.5，加水稀释至500ml。4℃保存。
    （4）底物缓冲液  称取3，3'-二氨基联苯胺盐酸盐（DAB）15mg ，取甲醇5ml、30%过氧化氢15μl，溶于25ml TTBS缓冲液中。用前配制。
    检查法  取硝酸纤维素膜，用EBM缓冲液浸泡15分钟，将供试品、阴性对照品（可用等量的人白蛋白）及阳性对照品点在膜上，上样量应大于10ng。室温干燥60分钟。取出硝酸纤维素膜，浸入封闭液（10%新生牛血清的TTBS缓冲液，或其他适宜的封闭液）封闭60分钟。弃去液体，加入TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的供试品抗体（参考抗体使用说明书的稀释度稀释），室温过夜。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，更换TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的生物素标记的第二抗体，室温放置40分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3 次，每次8分钟。弃去液体，更换TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的亲和素溶液和生物素标记的辣根过氧化物酶溶液，室温放置60分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗4次，每次8分钟。弃去液体，加入适量底物缓冲液置于室温避光条件下显色，显色程度适当时水洗终止反应。
    结果判定  阳性结果应呈现明显色带。阴性结果不显色。

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